線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性測(cè)試盒實(shí)驗(yàn)科研

測(cè)定意義：線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過程水解ATP。此外，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理：復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi，通過測(cè)定Pi增加速率來測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。

需要的儀器，耗材:可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。


樣本處理
1. 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1.0 mL 提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2. 4 ℃ 600g 離心 10min。

3. 將上清液移至另一離心管中，4 ℃ 11000g 離心 15min。

4. 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。

5. 在沉淀中加入 600μL 試劑一，超聲波破碎（功率 20%，超聲 5 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 12 次），用于復(fù)合體Ⅴ酶 活性測(cè)定，并且用于蛋白含量測(cè)定。